胶质母细胞瘤（GBM）是最常见和恶性的脑癌。标准治疗仅延长患者的生命数月，未选择的患者人群的中位生存期不到一年。肿瘤侵入周围脑实质的能力是一项重大挑战，因为它使完全切除无法实现。肿瘤切除术后留在脑内的侵袭性细胞对化疗和放疗有抵抗作用，因此导致肿瘤不可避免的复发。GBM细胞具有穿过高度堆积的神经纤维的能力，但很少进入循环。因此，胶质瘤细胞的侵袭不同于其他癌细胞的转移性扩散，并且可能依赖于一组独特的分子途径。此外，GBM显示高水平的肿瘤间和肿瘤内。异质性，其中只有一部分肿瘤细胞是侵入性的。为了理解侵袭的胶质瘤特异性特征，模型必须概括患者中看到的异质细胞表型，同时足够简单以允许解释。
　　 为了通过实验破译胶质瘤肿瘤细胞迁移和侵入大脑的能力，模型系统必须保留GBM的这一关键特征。传统的长期血清培养的GBM细胞系表达神经谱系的标志物，但显示出比起源肿瘤更常见于其他细胞系的分子特征。移植到大脑后，这些细胞会形成快速生长的肿瘤，但与脑实质的边界清晰界定-更像脑胶质瘤，而不是神经胶质瘤。相反，使用源自患者的GBM组织允许分离具有侵入性质的细胞。这些细胞可以作为肿瘤球在无血清，富含生长因子的培养基中繁殖，并在连续异种移植中建立亲本肿瘤的表型。重要的是，这些诱发的肿瘤是高度侵入性的，包含在整个大脑中广泛迁移的细胞。侵入性GBM细胞的特定生物学行为表明某些遗传程序的激活将其与肿瘤核心中的细胞区分开来。虽然已经广泛研究了神经胶质瘤的全局表达谱，但对侵袭性细胞中的特定基因表达知之甚少。实验研究探索与脑切片入侵相关的转录差异或体内异种移植模型不要使用允许分析运动模式的实时观察。因此，需要一种方法，允许通过实时观察对入侵GBM细胞进行转录组分析，确定入侵能力的差异。研究人员先前已经描述了器官型脑切片中入侵的神经胶质瘤细胞的表型和侵袭性特征。在这里，研究人员提出了人类GBM细胞入侵的实时量化研究与非侵入性和侵袭性细胞中转录谱的比较分析。使用简单的胶原3D矩阵系统，研究人员演示了该系统如何维持在更复杂的系统中发现的侵入特征，以及它如何允许检测内部和体内异质性以理解神经胶质细胞侵袭的机制。

细胞培养
　　 在挪威国家医学研究伦理委员会（07321b）批准后，从知情和同意的患者获得GBM活组织检查。将活组织检查分离成单个细胞，并在补充有bFGF和EGF的无血清培养基中培养，如前所述。从脑肿瘤活组织检查中建立了七种原代细胞培养物，所有这些都来自IDH野生型，未经治疗的GBM，其中一种被归类为巨细胞GBM。之前已经描述了其中两种文化（T0965，T1008）。在异种移植到SCID小鼠后证实了所有培养物的致瘤性。培养物中的肿瘤球显示出异质的形态和生长模式特征，群体倍增时间为2至8天。

用于时移显微术的GBM培养物的移植
　　 如前所述进行肿瘤球在纤连蛋白包被的平板上和啮齿动物脑切片中的平板接种。用于将肿瘤球移植到胶原凝胶大鼠胶原蛋白I蛋白（Gibco）根据制造商的推荐制备，并在24孔板中以30μl滴剂分布，然后通过2μl移液管将150-250μm的单个肿瘤球体移植到凝胶中。对于细胞悬浮液移植，使用含有约500个细胞的2μl。在肿瘤球与细胞悬液共同移植的实验中，通过在移植后立即开始的时间段成像来跟踪细胞，无论是悬浮液还是球形中的单细胞，都可以完成。在37℃下在细胞培养箱中凝胶化30至45分钟后，向移植物补充200μl补充有1％胎牛血清（FBS）的肿瘤球体培养基。在具有温度的OlympusIX81倒置荧光显微镜上进行间隔拍摄成像。和环境气体供应控制。延时实验持续1至5天，每20分钟成像一次。

入侵参数的量化
　　 为了定量方向性和迁移速度，使用带有手动细胞跟踪插件的ImageJ软件包Fiji进行图像的后处理。手动跟踪由两个独立的研究完成。方向性是迁移开始和终点之间的直线长度与总累积距离之间的比率，由IbidiChemotaxis和MigrationTool计算。总侵入性增量是侵入性细胞从肿瘤球体移出的所有距离的总和。通过ImageJ软件使用“FindMaxima”选项分析核染色移植物进行鉴定。

　　以前已经证明了在器官型脑切片培养中迁移GBM细胞的表型和侵入动力学。在纤维连接蛋白上铺板的细胞广泛用于评估“划痕试验”中的迁移，而3D蛋白质基质被认为是研究神经胶质瘤细胞侵袭的更好模型。为了在单细胞水平上进行更高分辨率的成像并最大限度地减少异质细胞外环境的影响，研究人员将这些条件下胶质瘤细胞的表型和运动模式与移植到脑切片培养物中的细胞进行了比较。在涂有纤连蛋白的塑料表面上铺板的细胞显示出片状或纺锤状形态，而没有表现出恒定的前导过程。它们的迁移是非定向的并且与随机形成的片状伪足有关。在将肿瘤球体附着到表面后，细胞迁移到汇合的单层中。相比之下，移植到3D胶原基质中的肿瘤球形成了入侵细胞的晕圈。胶原基质中的大多数入侵细胞采用神经祖细胞样表型，具有圆形小细胞体和长的前导过程。这与I型细胞相同，研究人员发现它们在器官型脑切片培养中占主导地位。这些细胞具有细长的细胞体，直径为5至25μm，并且具有独特的前导过程，其长度比细胞体长3至5倍。在侵袭性细胞中存在细胞异质性，并且在胶原基质中也发现了脑切片培养物中描述的所有细胞类型（II型，巨细胞和具有随机形态的细胞）。
　　 研究人员之前已经描述了来自肿瘤球的信号提示如何诱导和定向侵袭性肿瘤细胞在器官型脑切片培养中的迁移传播。研究人员使用三种不同的实验装置在移植到胶原基质的肿瘤球体中验证了这一点。首先，研究人员将GBM肿瘤球体分离成单细胞悬液，然后移植到胶原基质中。当没有肿瘤球存在时，细胞以非定向，随机的方式迁移。其次，研究人员将单细胞悬液移植到胶原基质上，然后共同移植来自同一肿瘤的肿瘤球。肿瘤球被共同移植后，靠近球体的一小部分细胞获得远离球体的定向，径向运动。然而，并非所有细胞都对共接枝反应。一小部分细胞，甚至靠近球体，通过引发定向迁移对球体的存在没有反应。这些细胞继续随机移动，跳过传入的入侵细胞流。第三，研究人员将肿瘤球体移植到胶原基质中，然后在24小时后通过显微外科切除除去肿瘤核心。肿瘤核心的切除中断了细胞的定向侵入性迁移，导致侵入性增量总和和方向性的减少。在对照移植物中，大多数细胞继续侵入迁移远离核心。因此，在没有肿瘤核心的情况下，细胞随机迁移，但是通过引入肿瘤球，开始靶向侵袭。即使在没有FBS的情况下，这种神经胶质瘤细胞的侵袭也得以保留。

胶质瘤细胞入侵是细胞培养特异性的
　　 将七种不同的原代建立的GBM培养物移植为胶原基质中的单个肿瘤球。对于每种培养物，进行20至70个独特的肿瘤移植物，其来自至少三个不同的传代。侵袭性模式在培养物之间显示出广泛的瘤间变异，但对于个体培养物是稳定的。尽管大多数实验是在早期传代（b5）进行的，但即使在体外长时间维持（直到第20代）之后，侵入模式仍得以维持。
　　 研究人员使用侵入细胞总数的估计和侵入性增量总和来量化五种培养物中的侵袭水平，以确认入侵的差异。因此，文化可以根据侵入性进行排名。在七种培养物中的五种中，研究人员发现侵入性增量在距离肿瘤核心的培养特异性距离处改变，并且该距离在48小时内达到。虽然侵袭性增量在肿瘤核心附近稳定，但细胞在达到此极限后失去方向性运动并开始随机移动（在所有分析样品中P<0.01）。除此之外，细胞的移动与研究人员在细胞悬液移植物和核心切除后观察到的相似。这些细胞在交替的方向上保持形成过程而不会导致定向推进。在具有最高侵袭（T1402和T1456）的两种培养物中，侵袭性细胞继续径向迁移，伴随着肿瘤核心密度和大小的逐渐减少，并且细胞继续迁移直至它们到达胶原凝胶的边界。