胶质瘤脑肿瘤细胞的弥漫性浸润性质阻碍了所有恶性细胞的成功手术切除，因此导致诊断为胶质母细胞瘤的患者的存活率较低。神经组织是体内最软组织中的一个正越来越多地认识到调节脑驻留细胞的生物学功能和脑组织的机械性质。迄今为止，研究人员对胶质母细胞瘤细胞如何能够在整个软健康脑组织中扩散的理解有限。当侵入性胶质母细胞瘤细胞穿过大脑时，它们会遇到不同刚度的区域和基质组成来描述。脑是软且机械异质组织，具有范围从非常柔软的微区域的刚性值，以更刚性区域高达。周围的空间，其中富含基底膜成分，和神经胶质，其含有纤维状胶原和非纤维状胶原是两个注意到胶质母细胞瘤细胞侵入。既基底膜提取物基质胶和胶原具有相同的柔软一致性作为脑和类似的基质组合物的血管周围空间和神经胶质，分别因此可以是用于模拟脑癌入侵的特征。
　　 通过细胞表面上的整联蛋白受体感知的组织力被转换成生化信号，其调节一系列细胞特征，包括细胞迁移和侵袭。研究在硬组织培养塑料或玻璃上生长的细胞比脑组织更坚硬因此可能对脑癌入侵的可能机制几乎没有任何启示。模型系统模拟脑组织的机械特征已经证明一系列由初级患者来源的胶质母细胞瘤细胞，包括刚度无关和刚性依赖性。值得注意的是，所有细胞在软基质上显示出一定程度的运动性。出现的上表面更硬做软衬底不会发生在精细的粘接剂和肌动蛋白的结构依赖于这些结构中，从而侵入的模型可能不适用于胶质母细胞瘤通过软脑组织移动。胶质母细胞瘤特征性地失去了肌动蛋白相关蛋白的特定子集，即高分子量原肌球蛋白。高分子量原肌球蛋白位于基于整合素的粘着斑的远端，细胞通过细胞外环境感知力。已经证明，原肌球蛋白在增强细胞外基质粘附所需的细胞力的精确周期性中起重要作用。在原肌球蛋白耗尽之后该控制失去，促进在软表面和硬表面上的相等扩散。类似地，激酶抑制介导的肌动蛋白丝上肌球蛋白运动活性的下调使细胞收缩性失效并促进胶质母细胞瘤细胞在软基质上的扩散和迁移。基于这些数据，研究人员假设原肌球蛋白的损失可以克服高水平的胶质母细胞瘤细胞收缩性，否则会消除软脑样表面上的细胞迁移。在本研究中，研究人员旨在确定原肌球蛋白在胶质母细胞瘤在软组织环境中传播中的作用。
　　 如所述，使用氨基硅烷化的盖玻片制造不同弹性模量的聚丙烯酰胺水凝胶。通过流变测定法测定所得凝胶制剂的模量。随后，用磺基处理活化凝胶表面。然后将活化的凝胶与在缓冲液中制备的胶原偶联，并在温育过夜。在冲洗去除未结合的胶原蛋白后，通过在层流柜中暴露于对凝胶表面进行消毒，并通过免疫荧光成像确认胶原偶联。通过澳大利亚的分析独立验证了研究中使用的所有品系的同一性。根据书面知情同意书和布里斯班皇家布里斯班妇女医院和医学研究所的人类伦理委员会批准，并按照批准的指南收集患者组织，如前所述。将细胞在补充中作为贴壁单层培养在过滤盖的组织培养瓶中。胶质母细胞瘤患者来源的细胞系由澳大利亚布里斯班医学研究所的脑癌研究所建立，并且之前已有描述。细胞系的基因型和表型特征可以在网站上找到。在培养箱中将细胞维持在。小鼠原位异种移植模型在昆士兰医学研究所动物伦理学批准下进行，严格按照伦理指南和实验室动物的使用进行，以最大限度地减少动物痛苦，并根据之前描述的方法。如前所述制备患者来源的细胞系的多细胞球体。使用胶原或未稀释的降低生长因子，乳酸脱氢酶升高病毒乳酸脱氢酶升高病毒制备水凝胶中的单细胞悬浮液。先前已经描述了用于单细胞悬浮的技术。将悬浮的单细胞溶液和多细胞球状体接种到玻璃底孔培养皿中。
　　 将细胞以低密度接种在浅培养皿上，经过等离子体处理以产生基质的粘合剂表面并随后偶联至纤连蛋白。使用以力量模式操作的测量细胞弹性，每个实验重复的所有参数相同。使用氮化硅尖端进行细胞扫描和力映射。在细胞中心上方的区域上进行初始形貌扫描以确定最高点。随后，在细胞区域以的压痕速度进行力映射，设定为的触发点，扫描地图。使用赫兹模型计算表观弹性模量。所有分析均在首先用固定细胞上进行。通过将细胞短暂暴露于细胞骨架稳定化缓冲液，然后通过细胞裂解在缓冲液中提取细胞骨架级分来制备原肌球蛋白提取物。新鲜补充蛋白酶抑制剂。用抗原肌球蛋白抗体和肌动蛋白抗体和辣根过氧化物酶缀合的二抗探测印迹。用化学发光试剂盒显色印迹。将细胞用在室温下固定，并用甘氨酸洗涤淬灭背景荧光几分钟。然后将细胞用并在封闭溶液中于温育过夜。使用三盐酸盐三水合物检测细胞核。使用制备包括颜色调整的最终显微照片图像。使用软件通过免疫印迹的光密度分析来定量蛋白质表达。使用制备所有图和统计分析。使用软件进行细胞形态学的整合形态学分析。通过快速傅里叶变换过滤鬼笔环肽染色细胞的共焦切片的最大投影以均衡图像背景强度。然后应用低通滤波器来定义单元轮廓，最后应用轻物体的自动阈值。手动分离图像阈值后连接的细胞，而通过参考合并的和鬼笔环肽染色细胞的相应的非阈值最大投影来手动连接在阈值处理后被鉴定为断裂的那些。使用的神经突向外生长函数进行细胞分支分析。如果细胞被连接或者神经突向外生长被错误地检测到，则细胞从分析中打折扣。
　　 先前的报道表明胶质母细胞瘤缺乏高分子原肌球蛋白同种型的表达，分析了用原肌球蛋白抗体染色的整个肿瘤组织切片，其与多种原肌球蛋白同种型交叉反应。为了确定原肌球蛋白是否从胶质母细胞瘤中丢失，研究人员因此通过蛋白质印迹分析了一组原发的患者来源的胶质母细胞瘤系与两个连续培养的胶质母细胞瘤系的比较。连续培养的细胞系通过抗原肌球蛋白抗体检测的原肌球蛋白同种型谱表达原肌球蛋白和第二原肌球蛋白同种型，原肌球蛋白。在细胞裂解物中未检测到原肌球蛋白和原肌球蛋白。与细胞类似，分析的四条主要细胞系中均不存在原肌球蛋白。值得注意的是，只有细胞系保留原肌球蛋白表达，并且所有四个细胞系都保留了低分子量同种型原肌球蛋白。重要的是，每个患者来源的胶质母细胞瘤细胞系在小鼠原位异种移植物中表现出脑组织的弥漫性侵袭。这些图像证实了细胞在整个健康脑组织中的广泛传播。
　　由于细胞中原肌球蛋白的阳性表达，研究人员使用该细胞系来研究原肌球蛋白的功能。研究人员首先证实胶质母细胞瘤细胞显示出刚性敏感的细胞扩散，如先前报道。这是使用具有不同弹性模量的结合的聚丙烯酰胺水凝胶以模仿由大脑侵入神经胶质瘤细胞中遇到的机械环境来实现。引人注目的是，研究人员发现原肌球蛋白表达在最柔软的底物上显着降低，其中细胞具有较小的面积。原肌球蛋白表达上更硬的衬底。此外，外源性原肌球蛋白在较硬的基质上诱导明显更大的细胞扩散。值得注意的是，膜弹性不受影响过原肌球蛋白敲低所示，因此细胞扩散的变化不是由于在细胞膜遵守总体变化。有人指出，原肌球蛋白时表达也显著下调最柔软的表面中，这表明该同种型也可以响应于不同的机械环境中发挥肌动蛋白丝功能特化中起重要作用。为了研究复制大脑机械特征的软环境中原肌球蛋白和原肌球蛋白表达的形态学结果，在每种同种型的敲低后将细胞包埋在胶原凝胶中。原肌球蛋白击倒显著增加细长的，蔓延细胞三维胶原凝胶所示。观察到原肌球蛋白敲除细胞延长长而细的神经突状突起和该表型的定量确认：它相比增加显著来控制细胞。与此相反，原肌球蛋白时击倒增加的细胞四舍五入和神经炎性降低支化。
　　 为了确定对原肌球蛋白消耗的形态学反应是否是基质依赖性的，将细胞交替地悬浮在三维基质胶水凝胶中。基质胶中的对照细胞形态与胶原蛋白中的控制细胞形态明显不同;在基质胶，细胞主要圆的。尽管在对照条件下这种差异，原肌球蛋白时耗尽具有基质胶和胶原蛋白上的形态相同的效果，诱导两个矩阵。有趣的是，原肌球蛋白时耗尽了在三维基质胶。因此，这些数据表明原肌球蛋白是任一环境中形态学的重要调节剂，而原肌球蛋白似乎仅影响基于胶原蛋白的环境中的形态。看出以下原肌球蛋白时拦截细胞形态出现类似于先前报道的在三维胶原培养。研究人员表明，用激酶抑制细胞也诱导的细胞伸长和在三维胶原培养神经突状突起。在基质胶的培养物中观察到的相同的效果中。总的来说，这些结果揭示了原肌球蛋白敲低表型对激酶的抑制作用。研究人员接下来评价以下原肌球蛋白时敲低细胞变圆是否是类似的形态切换到圆形细胞，其通过用抑制剂。有趣的是，抑制与仅诱导在基质胶四舍五入，而不是胶原。这种反应是在对比到原肌球蛋白敲低，从而诱发在胶原四舍五入，但不是因此原肌球蛋白的作用与抑制作用不同。
　　 研究人员接下来质疑三维培养中主要患者衍生系的形态是否可以通过其原肌球蛋白原肌球蛋白表达谱预测。为了更好地模拟体内样环境，首先允许细胞在嵌入三维水凝胶之前形成多细胞球状体。这种方法既模型，该扩大的肿瘤施加在周围组织和局部的牵引力使细胞对周围组织。基于分别在原肌球蛋白和原肌球蛋白敲低后胶原蛋白的延伸与圆形表型，预测缺乏这两种同种型的细胞将具有三维中的圆形和细长侵入细胞的混合表型。胶原。相反，鉴于原肌球蛋白敲低对基质胶中的细胞形态没有影响，预期所有细胞系，无论原肌球蛋白表达如何在基质胶中培养时都具有延长的形态。与这些预测一致，细胞系均显示细胞和圆形细胞的混合物，这些细胞侵入胶原蛋白中的主要球状体。相比之下，保留原肌球蛋白表达的细胞分别显示细长的形态和细长的形态，在胶原蛋白中具有长而薄的神经突样过程。当球状体在三维基质胶中培养时，所有细胞系都显示出转变为延长的细胞侵袭，细胞共同表现出细长细胞的入侵链。总之，这些数据表明，原肌球蛋白的缺失引发高级间质细胞侵袭的高级胶质瘤细胞，并且这在基质胶水凝胶中占优势，复制体内血管周围基底膜成分。
　　 防止胶质母细胞瘤传播和杀死传播的胶质母细胞瘤细胞是重要的临床目标。胶质母细胞瘤细胞侵入软脑环境的能力意味着需要模仿大脑生物力学特征的模型系统才能理解胶质母细胞瘤的传播。研究人员的研究表明，胶质母细胞瘤中原肌球蛋白的特征性丢失可能促进细胞通过软脑组织扩散，从而确定了胶质母细胞瘤传播的重要新机制。原肌球蛋白敲低表明复制激酶在软胶原蛋白和基质胶水凝胶环境中的作用的发现弥补了先前关于刚性感应机制的报道。也就是说，原肌球蛋白敲低导致细胞在软环境中均匀分布，通过解耦刚性感应机制激酶抑制类似地解耦刚性感应并在软基质上诱导细长的星状细胞。由此产生的分支细长细胞过程有助于细胞探索局部组织环境。这可能使细胞暴露于一系列线索，例如，组织拓扑结构和趋化因子梯度的变化，这些变化一起可以促进传播。当在使用刚性基底建立的机制的框架中考虑时，在基于肌球蛋白的收缩性降低的条件下的细胞伸长最初似乎是反直觉的。这些模型在前缘定义了膜突出和粘附的循环，然后在粘着斑位点形成肌动蛋白应力纤维。肌球蛋白电动机与肌动蛋白丝的结合然后产生推进细胞体向前所需的收缩力，随后分离粘着斑。因此令人惊奇的是在胶质母细胞瘤细胞在不存在原肌球蛋白时激酶活性的软条件有效地扩散，因为这两个条件减少雅图肌球蛋白细丝形成和粘着增强。然而，与成熟肌动蛋白应力纤维相关的粘连相比，激酶抑制后保留的前体粘连介导对细胞外基质的更强粘附力。此外，虽然原肌球蛋白耗尽刺激了应力纤维的损失，但细胞保留了皮质丝。因此，前体粘连和收缩性皮质肌动蛋白细胞骨架可足以在软组织环境中诱导细胞扩散和伸长和扩散。最近开发的靶向特异性原肌球蛋白同种型的药物表明，有可能治疗性地靶向皮质肌动蛋白特异性原肌球蛋白同种型，从而抑制胶质母细胞瘤侵袭。或者，有可能针对调节前体粘连形成的信号传导途径，这可能证明比恢复刚性传感更具临床可行性，但具有相同的功能结果。
　　 虽然这项研究主要集中在原肌球蛋白损失，但它也描述了其他原肌球蛋白同种型的表达。从检查的限制性原肌球蛋白同种型库中，证明主要患者衍生的胶质母细胞瘤系保留原肌球蛋白表达。结果表明，原肌球蛋白敲低诱导胶原蛋白细胞变圆，但对基质胶没有影响。与这一发现相一致，已失去原肌球蛋白和原肌球蛋白的细胞在胶原蛋白中表现出混合的圆形和细长表型。此外，证明了原发患者来源的胶质母细胞瘤系保留了原肌球蛋白表达。重要的是，建议使用原肌球蛋白来推动前沿扩展和单元迁移持久性。针对原肌球蛋白可能是胶质母细胞瘤反传播治疗的有用目标。在本研究中，使用培养模型概括了不同胶质母细胞瘤入侵途径的生物力学特征和基质组成，揭示了原肌球蛋白下调在传播胶质母细胞瘤中的重要作用。由此产生的对胶质母细胞瘤细胞骨架如何专门用于穿过软脑环境的新理解可能有助于鉴定胶质母细胞瘤的新型治疗方法。