胶质母细胞瘤（GBM）是一种普遍致命的脑癌，迫切需要针对特定潜在致癌事件的新疗法。尽管已经显示WNT途径在GBM中经常被激活，构成潜在的治疗靶标，但是该途径的激活剂WNT6的相关性仍然是未知的。在GBM中评估WNT6蛋白和mRNA水平。在GBM细胞中沉默或过表达WNT6水平以评估体外和体内的功能效应。磷酸激酶阵列和TCF / LEF报告分析用于鉴定WNT6信号传导途径，并且在患者中验证了与干细胞特征和癌症相关途径的显着关联。用Cox回归和Log-rank检验进行生存分析。Meta分析用于计算估计的汇总效应。研究人员显示WNT6在GBM中显着过表达，与低级别胶质瘤和正常脑组织相比，在mRNA和蛋白质水平上。功能上，WNT6增加GBM细胞中典型的致癌活性，包括活力，增殖，胶质瘤干细胞能力，侵袭，迁移和对替莫唑胺化疗的抗性。一致地，在体内使用过表达和沉默模型的原位GBM小鼠模型，WNT6表达与较短的总体存活率和肿瘤侵袭性的增加的特征相关。在机制上，WNT6有助于激活典型的致癌途径，包括Src和STAT，其与WNT途径交织可能是GBM中WNT6相关侵袭性的关键效应物。临床上，研究人员建立WNT6作为一个独立的预后生物标志物，来自几个独立队列的GBM患者的生存期较短。研究人员的研究结果表明WNT6是GBM中的一种新型致癌基因，为开发更合理的治疗方法开辟了治疗这种高度侵袭性肿瘤的机会。
　　 胶质母细胞瘤（GBM）是成人中枢神经系统中最致命的脑肿瘤。尽管最近在对致癌分子机制的理解以及神经影像技术，手术和辅助治疗的改进方面取得了进展，但GBM患者仍然表现出快速不利的临床进展。患者的中位生存期为诊断后15个月，还没有在过去的几十年。结合其对大多数常规疗法（包括放射疗法和替莫唑胺（TMZ））的耐药性，GBM具有高度浸润性和弥散性，阻碍了完整的手术切除。在这种情况下，了解导致这种肿瘤侵袭性的关键潜在分子机制可能是设计新的和更有效的精确疗法的关键步骤。
　　 Wnt信号传导途径的多效性显示生理功能，从神经发生干细胞增殖，和在各种人类癌症，包括神经胶质瘤已牵涉。此途径在癌症干细胞（CSC），其已指出癌症复发和电阻的关键介质到无线电和化学疗法。因此，新的治疗策略靶向Wnt途径的特定组件已广泛。所述WNT6配体是Wnt途径，其中只有最近在胃和膀胱癌与化学抗性相关联的活化剂，食道鳞状细胞癌患者的，和增加的风险发展结直肠腺瘤。重要的是，迄今为止没有研究探讨过WNT6在人脑胶质瘤中的相关性。

WNT6在原发性GBM组织中过表达
　　 而高WNT6表达水平在不同人癌细胞系，知之甚少在肿瘤中其特定的角色，尤其是在GBM。为了解决这个问题，研究人员首先分析了存在于TCGA中的正常大脑，低级别胶质瘤（LGG，WHO II级和III级）和GBM（WHO级IV）患者的基因表达阵列数据。当与正常样品，WNT6未在任何的LGG患者（0/27）中过表达，而GBM患者的15.6％（572分之89）呈现高WNT6水平。一致地，在神经胶质瘤组织的另一数据集的测试通过免疫组织化学（IHC）WNT6的蛋白水平（从医院圣安东尼奥; HSA）显示，仅GBM中WNT6蛋白的本高表达 。在神经胶质瘤WNT6免疫反应性的表达，证实是主要细胞质（闭合箭头），具有漫射图案，其中几乎所有的肿瘤细胞是阳性，或更为散射图案。肿瘤浸润淋巴细胞为阴性WNT6表达所示，与内皮细胞为负或显示出一些微弱的免疫反应性。显示了阳性和阴性对照以及苏木精和伊红染色的代表性图像。总之，这些结果显示WNT6 mRNA和蛋白质水平与高胶质瘤等级相关，表明它在胶质瘤的病理生理学中可能是重要的。

高WNT6表达不加区别地存在于GBM的所有分子亚型中
　　 一些已经做出努力，以分层GBM成分子亚组。研究人员在总共4个独立队列中评估了部分研究人员（经典，间充质，神经和俯卧） 描述的GBM亚型中WNT6表达水平，共有201名来自TCGA的患者，59名来自Freije，159名来自Gravendeel和来自Vital数据集的26。与在所有的数据集（每个GBM分子亚型的患者亚群没有显著差异检测WNT6的高水平），在GBM提示WNT6活化是独立于这些分子签名。

WNT6具有致癌功能并在体外促进GBM侵袭性
　　 为了解决WNT6表达是否影响GBM细胞的典型癌症标志特征，WNT6表达被沉默在通过shRNA的U373MG和SNB19细胞系，导致显著降低的mRNA和蛋白水平，以及过表达在U87MG细胞，这不表达WNT6内源性。当与相应的WNT6高同行。伴随地，WNT6沉默显著降低GBM细胞的增殖。考虑到GBM细胞显示出显着的迁移和侵袭潜力，研究人员测试了WNT6如何影响GBM的这些标志性特征。伤口愈合迁移测定和基质胶侵袭测定表明，WNT6显著增加GBM细胞的能力，以迁移和侵入。总之，这些数据表明WNT6是调节几种癌症标志的重要因素，这可能会影响GBM的侵略性。

WNT6增加GBM细胞对替莫唑胺化疗的耐药性
　　 以前的报告中所描述的Wnt通路的相关性增加的许多癌症的抗放射和化学疗法。在这方面，研究人员测试了WNT6表达是否可能对GBM细胞对临床相关疗法（包括TMZ化学疗法和放射疗法）的敏感性产生影响。有趣的是，与其各自的对照细胞相比，WNT6沉默的GBM细胞对TMZ介导的细胞死亡显着更敏感。相反，WNT6不影响GBM细胞对放射治疗的敏感性。总体而言，这些结果表明WNT6促进GBM细胞对TMZ的抗性，具有潜在的临床意义，因为TMZ仍然是这些患者的标准治疗。

WNT6促进胶质母细胞瘤干细胞特征
　　 由于GBM干细胞（GSC）在GBM患者的病理生理学和临床结果中的关键作用，研究人员研究了WNT6如何影响GBM细胞的干性。有趣的是，WNT6沉默U373和SNB19细胞显示突出降低Nestin和SOX2蛋白的GSC的两种常见的标记物。此外，WNT6表达导致U373，SNB19和U87细胞的显著更高的容量，以形成神经球GSC条件下，功能性地表明WNT6有助于GBM细胞的干细胞表型。一致地，WNT6表达导致了对shCtrl对1 / 16.11 shWNT6极限稀释球形成测定法，测定这允许定量具有干细胞特性的细胞，所述细胞能够形成源自单个细胞的新神经球。
　　 除了基于球体的干细胞测定外，研究人员还测试了在允许GSC扩增的特定贴壁条件下培养的U373和SNB19细胞（在层粘连蛋白包被的孔中补充了B27，EGF和FGF的神经球培养基）。GBM细胞获得在这些粘附干细胞条件多个细长的表型，如先前所描述的。与研究人员在“非干细胞”条件下的发现一致，WNT6沉默显着损害了粘附干细胞样条件下生长的U373和SNB19 GBM细胞的细胞活力）。在全球范围内，这些数据表明WNT6在GSC的形成和维持中具有重要的功能作用。

WNT6与GBM临床样品中的干细胞相关基因相关
　　 为了进一步将研究人员的结果转化为临床环境，研究人员评估了来自TCGA的GBM患者中WNT6和典型干细胞相关基因的表达水平之间的相关性。各种干细胞相关基因之间的基因表达的有趣的是，热图分析显示共同模式WNT6个体相关的曲线图，并且显示的表达水平之间统计学显著正相关WNT6和这些基因。来自GBM患者的这些数据与研究人员的体外拟合良好 研究结果进一步表明WNT6有助于GBM细胞的干细胞表型。

WNT6通过β-连环蛋白依赖性WNT信号传导和SFK / STAT途径的下游靶标起作用
　　 为了探索WNT6影响GBM侵袭性的潜在分子机制，使用人磷酸激酶抗体阵列在U373和SNB19细胞系中评估了多种癌症相关激酶的活化状态。属于非受体酪氨酸Src家族激酶的4种蛋白质的磷酸化水平，和p-HSP27（S78 / S82），热休克蛋白（HSP）的成员在U373和SNB19GBM细胞中WNT6沉默后，家族显着降低。此外，两种细胞系中WNT6沉默后，β-连环蛋白的总水平也降低。
　　 值得注意的是，其他信号传导途径在两种细胞系中均匀地受WNT6沉默影响，但是在不同蛋白质水平上。例如，通过直接影响该途径的两种主要介质AKT和mTOR的活化残基的磷酸化，在U373细胞中PI3K / AKT / mTOR途径活化减少。虽然这些特异性蛋白质在SNB19细胞中没有显着改变，但该途径的其他下游靶标，例如p70 S6K和eNOS，显示磷酸化水平降低，全局导致PI3K途径的类似降低的信号传导。值得注意的是，在WNT6沉默的U373和SNB19细胞中STAT3磷酸化水平发生了改变，但在不同的残基处：U373细胞中丝氨酸727（S727）的磷酸化水平增加。尽管这些STAT3残基的磷酸化水平形成对比，但生物学意义相同，因为S727磷酸化失活，而Y705磷酸化激活STAT3活性。
　　 除了在两种细胞系中同时受影响的这些信号传导途径之外，还观察到细胞系特异性作用，例如U373细胞中JNK，GSK-3a / b和EGFR的磷酸化以及STAT2，STAT5a，STAT5a的磷酸化的改变。 SNB19细胞中的/ b，PDGFRb和c-Jun。同样，尽管存在细胞特异性作用的这些实例，但WNT6的沉默始终导致GBM中这些癌症相关途径的活化状态降低。如在阵列执行。有趣的是，WBs显示U373细胞中p-STAT3 Y705略微减少，并且SNB19细胞中更明显的减少，如磷酸化阵列中所证明的。类似地，在两种细胞系中观察到WNT6沉默后非p-β-cat S33 / S37 / T41水平的显着降低，而仅有U373呈现降低的p-AKT S473磷酸化水平，进一步验证了磷酸阵列数据。
　　 总之，这些结果表明WNT6不仅通过β-连环蛋白依赖性WNT信号传导，还通过激活SFKs / STAT途径的下游靶标，突出WNT6作为参与GBM中各种关键信号通路的关键分子，这与在体外和体内观察到的致癌功能效应相关，并揭示了在WNT6-高GBM中治疗干预的推定新靶点。

水平的WNT6表达与GBM患者的较短总体存活相关
　　 由于研究人员的数据证明了WNT6在体外和体内 GBM侵袭性中的关键作用，以及它与GBM关键信号传导途径的关联，研究人员研究了WNT6在各种GBM患者数据集中表达的临床意义。在研究人员葡萄牙的数据集（医院布拉加和圣玛丽亚医院，N = 51），高水平的WNT6 mRNA表达显著与GBM患者。重要的是，这种高WNT6之间的联系GBM患者的mRNA水平和预后不良在另外3个独立数据集中进一步验证：Freije（n = 59），Gravendeel（n = 159）和Vital（n = 26）数据集。这些发现随后在407 GBM患者中得到了TCGA可用生存数据的验证，其中多变量Cox模型显示WNT6表达较高值与GBM患者较短OS 之间存在统计学显着相关性（p= 0.030），与其他预后变量无关，包括患者年龄（p <0.0001），Karnofsky表现状态（KPS; p = 0.001），性别（p = 0.037）和化学疗法或放射疗法治疗。此外，通过IHC在GBM巴西队列（n = 87）中评估的高水平WNT6蛋白表达也显示出较短OS的明显趋势，强调WNT6的mRNA和蛋白质水平均可用作临床上有价值的生物标志物。为了加强这个关联，元分析，包括所有独立的数据集显示，WNT6高表达在全局范围内的GBM患者的生存期较短。总之，这些结果表明WNT6表达可能是对GBM患者分层有用的新的预后因素。
　　 Wnt途径的失调的信令已经报道在几种人类癌症，包括GBM，并已与治疗的抗性相关。这部分是由于WNT信号传导维持的干细胞特征，如增殖和迁移增加。本研究首次剖析了人类GBM中WNT6激活介导的功能作用和潜在分子机制，将其建立为临床相关的预后生物标志物。由于其在胚胎发生过程中的关键功能，失调WNT6的表达在成人可能有利于肿瘤发生。研究人员的数据显示，WNT6在胶质瘤的表达是等级依赖性的，在基因和蛋白水平，同样地什么其他Wnt配体，从而WNT6与相关联胶质瘤的恶性程度增加。此外，研究人员的研究结果表明WNT6对GBM细胞活力，增殖，胶质瘤干细胞能力，侵袭，迁移和对TMZ化疗敏感性的显着影响，全面暗示WNT6是胶质瘤中重要的致癌因子。这是与其他Wnt配体的在GBM的已知影响。根据CSC的定义，研究人员发现WNT6表达不仅与癌症干细胞相关基因的表达相关，而且在功能上影响GSC的自我更新能力。与功能效应一致，分子数据还显示WNT6与GBM细胞和患者样品中的典型GSC标记物相关。