谷氨酸是中枢神经系统中一种主要的兴奋性神经递质，对调节思维，运动，记忆和大脑控制的其他更高功能至关重要。谷氨酸信号传导的失调与严重的神经病理状况相关，例如癫痫和神经胶质瘤，一种脑癌。谷氨酸信号目前由几种类型的神经化学探针检测，范围从基于微透析的到基于酶的碳纤维微传感器。但是，衡量能力存在重要的技术差距谷氨酸动力学是连续的，实时的，并且来自大脑中的多个位置，这限制了研究人员进一步理解潜在的神经病理学的时空机制的能力。为了克服这一限制，研究人员开发了一种酶促谷氨酸微生物传感器，其形式为陶瓷基板启用的铂微电极阵列，可连续，实时地测量来自多个记录位点的谷氨酸浓度的变化。此外，开发的微生物传感器对谷氨酸的敏感性几乎是文献中先前报道的酶传感器的四倍。进一步分析研究人员的微生物传感器记录的谷氨酸动态星形胶质细胞中和神经胶质瘤细胞分别清楚地区分正常与受损的谷氨酸摄取。这些结果证实，所开发的谷氨酸盐微生物传感器阵列可以成为监测和理解谷氨酸信号传导及其在正常和病理条件下的调节的有用工具。此外，所开发的微生物传感器可用于测量潜在治疗药物治疗一系列神经疾病的效果。
　　谷氨酸，最显着的兴奋性神经递质的哺乳动物中央神经系统，紧密整个大脑，要么在过少或过多的谷氨酸的存在控制突触是有害的。在突触间隙中，过量的谷氨酸浓度会过度激活离子型谷氨酸受体，导致神经元损伤和死亡，称为兴奋毒性。谷氨酸不被降解突触间隙中的酶活性。它从突触通过移除扩散和细胞摄取，例如通过兴奋性氨基酸转运蛋白，主要是兴奋性氨基酸转运蛋白和兴奋性氨基酸转运蛋白，在星形胶质细胞上表达。兴奋性毒性与癫痫发作有关。有人提出，谷氨酸摄取受损有助于癫痫发作和胶质瘤患者的癫痫发作。兴奋性氨基酸转运蛋白在神经胶质瘤细胞中下调，导致谷氨酸摄取受损。此外，一些胶质瘤细胞通过释放谷氨酸，依赖性谷氨酸/胱氨酸交换剂，进一步增加周围神经元组织中的谷氨酸。神经胶质瘤细胞受到关注。因为胶质瘤细胞占恶性脑肿瘤，并且死亡率高。可以测量谷氨酸动力学并实时区分正常和受损谷氨酸吸收的生物传感器可用于评估现有治疗方法和开发相关疾病的新治疗方法。
　　可植入探针已用于测量细胞外谷氨酸水平。实例包括微透析探针和水凝胶涂覆的碳纤维微电极和微电极阵列。通过生化测定或比色测定检测星形胶质细胞谷氨酸摄取是高度敏感的但不能提供高空间分辨率和谷氨酸动态的实时测量。然而，当研究神经疾病的细胞和电路机制时，测量细胞外谷氨酸释放和摄取是必要的。与微透析相比，使用安培法测量技术的微型电化学微电极提供快速，灵敏和选择性的谷氨酸实时记录，并改进它们的灵敏度和选择性一直是许多研究的主要焦点。碳纤维微电极对电活性神经化学物质具有高度敏感性。然而，它们在慢性体外试验中对生物污垢的抵抗力低，并且很快失去其有效表面积，从而失去其敏感性。微电极阵列的提供一些优于碳纤维微电极，包括多个记录点，它可能导致更好的空间分辨率，复用，高谷氨酸的灵敏度，以及通过其对过氧化氢的优异敏感性的谷氨酸检测下限，过氧化氢是谷氨酸氧化酶包被的生物传感器上的谷氨酸氧化的副产物。的谷氨酸范围涂覆酶-铂微电极是纳米，而碳纤维微电极的谷氨酸。
　　 微电极阵列可以用不同的记录位点几何形状和不同的基底制造。基于陶瓷基板的微电极阵列由于其减少的电极串扰而是有利的。基于陶瓷的微电极阵列已广泛用于测量谷氨酸水平。它们具有良好的特征，与生化分析相比具有优异的时空分辨率，可用于研究多种分析物，并可提供用于干扰消除的自参考站点。因此，这些微电极阵列为开发和测试新的微生物传感器方法提供了良好的基础。在这里，研究人员使用基于陶瓷的微电极阵列，使用滴铸法开发基于酶的电化学微电极阵列微生物传感器探针。研究人员测试了这种新探针的实时测量能力和体外细胞外谷氨酸的高灵敏度星形细胞摄取。该探针具有的检测范围谷氨酸与灵敏度的基础培养基和在磷酸盐缓冲盐水溶液。与其他类似改良的微电极阵列微生物传感器相比，后者的灵敏度平均提高。此外，研究人员使用新探针来区分健康星形胶质细胞培养物中的正常谷氨酸摄取和神经胶质瘤细胞系中的摄取受损。
　　 为了制造研究人员的谷氨酸微生物传感器探针，研究人员使用滴铸法手动涂覆商业微电极阵列探针和氧化酶。由于其众所周知的电化学性质，选择铂作为谷氨酸电化学传感的电极材料。探针是基于陶瓷的微电极阵列，具有四个微电极位点。微电极阵列涂覆有氧化酶，如先前所述。在涂覆之前，用异丙醇和去离子水清洗探针。然后用吹干并在烘箱中进一步干燥。对于酶涂层，将氧化酶酶在去离子中混合以制备等分试样并在到达时储存在。在涂覆之前，将等分试样在冰盒中转移到实验室中并在解冻，然后在室温下解冻。将去离子水加入离心管中。在使溶解后，向其中加入戊二醛溶液中。研究人员将溶液混合物在室温下保持几分钟。将体积的混合物添加至的氧化酶中并离心以形成氧化酶戊二醛的最终酶-基质混合物。使用微量注射器在尼康立体显微镜的帮助下将酶溶液手动滴入微电极阵列记录部位。对每对记录位点总共施加四滴溶液。得到的酶膜厚度，使用激光扫描共聚焦显微镜测量。然后将探针在储存几小时铝箔中在用尺寸排阻聚合物涂覆之前，在没有暴露于光的情况下覆盖的储存容器，以防止干扰物到达生物传感器表面以增强探针选择性。以安培法模式获得谷氨酸记录，对显影的微电极施加恒定电位，而参比电极由涂覆的银线。使用四通道电化学记录系统记录谷氨酸时间动态。
　　 在每次记录会话之前，首先使用安培法技术在磷酸盐缓冲盐水缓冲液中校准生物传感器探针以评估它们的基线灵敏度。对于电流分析测量，使用电极配置的多通道恒电位仪与涂有参比电极。施加的电位用于过氧化氢检测。校准在磷酸盐缓冲盐水溶液中进行，该溶液以搅拌并保持。在观察到稳定的基线后，使用将谷氨酸引入溶液中注射泵以获得所需浓度的谷氨酸。在进行实验的同一天新鲜制备溶液。所有测量重复几次。在每次体外记录期间，生物传感器探针在基础培养基中校准。为了建立校准曲线，将组织培养处理的培养皿放入一个定制的培养箱系统中。保持探针使得所有四个探针位点浸没在培养皿的中间，并且用于精确分配谷氨酸的显微注射器尖端保持距离探针，并且参比电极保持距离探针。对于每个实验期，使用坚固的探针和注射器尖端保持器将这些组分始终相对于细胞培养皿置于相同位置。将生物传感器和参比电极浸入培养基中，在建立稳定的基线电流后，通过微量移液管以逐渐增加的浓度添加谷氨酸最终培养基浓度为。此外，为了比较星形胶质细胞与胶质瘤细胞中的谷氨酸摄取，在具有细胞的实验培养皿中将相同的逐步增加的谷氨酸浓度添加到相同体积的培养基中。
　　 新生儿衍生的星形胶质细胞的大鼠脑皮质在组织培养处理的培养皿中与大号谷氨酰胺和钠碳酸氢盐与马血清，和青霉素。大鼠神经胶质瘤细胞培养在组织培养物处理的培养皿中在高葡萄糖中，用大号-谷氨酸，碳酸氢钠，加入胎牛血清，非必需氨基酸溶液和青霉素。在铺板细胞前一天，将培养皿用聚赖氨酸包被。星形胶质细胞和肿瘤细胞均以每盘细胞接种。将细胞在在潮湿环境中与缓冲液。并且生长至汇合以进行实验。多天使用多次细胞铺板。在实验之前，对细胞进行成像，然后用新鲜，温热，无血清的基础培养基和碳酸氢钠和不含谷氨酰胺替换培养基。在谷氨酸摄取测量实验完成后，再次对细胞成像。细胞的形态用于定性评估细胞的相对健康状况。虽然细胞在实验结束时的形态有时略微变窄，但它们仍保持粘附并在培养皿上扩散，这意味着细胞存活并发挥作用。由于这些实验的长度和探针对温度变化的敏感性，将细胞培养皿保持在置于台式培养箱内的自制水浴中。微电极阵列还对实验室中的灯，电机和其他设备的电噪声敏感。因此，只在必要时打开培养箱门。在每个实验开始时将加入培养箱环境中几分钟以支持细胞培养基的缓冲。将探针置于培养皿的中心，使所有四个微电极完全浸没在培养基中。在培养皿的外缘附近添加谷氨酸，以最大限度地减少记录中的运动伪影。使用微透析自动注射泵将精确体积的谷氨酸溶液滴入细胞培养皿中的培养基中。大鼠幼崽与大坝一起饲养。根据路易斯安那理工大学机构动物护理和使用委员会批准的方法并遵照指令，通过颈椎脱臼对幼犬实施安乐死。
　　 使用来自软件评估在添加谷氨酸后从生物传感器的当前迹线得到的三个参数。具体而言，用于测量峰值最大值。上升时间小工具用于测量上升和下降次以及下降速度。整合小工具用于评估谷氨酸添加后响应半最大值。也称为全宽半最大值，是最大峰值一半处的曲线宽度。上升时间，是从迹线上升到峰值的。下降时间是从峰值回到稳定迹线的电流减少的时间。下降时间的线的斜率是清除率，其也被称为落下速度。比较来自培养的星形胶质细胞和细胞的当前痕量参数的平均值的差异，同时考虑浓度的变化和阻断实验进行的天数的影响。多变量方差分析用于解释三者之间可能的模式和依赖性因变量在本研究中减少了错误的概率。研究人员还进行了一系列方差分析，以研究星形胶质细胞和细胞在每个反应变量上的平均探针测量值的差异。一个频道在研究结束时停止提供信号。对于星形胶质细胞，这导致三个而不是四个痕迹用于一个记录日，对于神经胶质瘤细胞，这导致两天。为了调整缺失的数据，研究人员使用了均值插补法。但是，为了确保数据插补不会严重扭曲研究人员的数据分布或影响研究人员的结果，研究人员还使用不平衡数据进行了多变量方差分析和方差分析测试。对于每种方法，推算和非推算，统计显着性阈值。虽然在没有插补的情况下更大，但是研究人员的三个测量参数的平均值差异的统计显着性没有变化。对于这两种方法，均值的差异对于两个参数是显着的而对于另一个参数则不显着。测量值表示为平均值平均值的标准误差。
　　 为了确定研究人员的手动涂覆和电沉积微电极的电化学特性，进行了两个测试：在基础培养基中测试以确定谷氨酸和用于确定生物传感器灵敏度的急性培养基校准。尽管来自的微电极阵列探针已被充分表征，但可能已经发生了由于手工和电沉积涂覆过程中的工艺变化而导致的记录性能的可能变化。灵敏度为在磷酸盐缓冲盐水缓冲液中的体外条件溶液与公开的文献相比获得了。这种敏感性的增加部分是由于涂覆在微电极阵列位点上的酶数量的增加而引起的。此外，生物传感器表现出长期稳定性，当在室温下在去离子水中储存时，谷氨酸敏感性的变化最小。为了确定对谷氨酸的响应的谷氨酸和线性部分，在安培法模式中使用恒定电位获得大范围谷氨酸浓度的测量值。研究了在未搅拌的基础培养基中谷氨酸浓度范围谷氨酸。从浓度响应数据可以看出，生物传感器饱，超过此浓度，谷氨酸浓度不再导致电流增加。电流与浓度呈线性关系，谷氨酸。在未搅拌的基础培养基的探针的平均灵敏度。其中是基线的标准偏差。生物传感器的谷氨酸在培养基，在磷酸盐缓冲盐水缓冲。在每次体外测试之前产生谷氨酸浓度与基础培养基中的电流的校准曲线。将谷氨酸生物传感器定位在培养皿的大致中心上并浸入基础培养基中，流体覆盖所有四个部位。在达到稳定的基线后，将基础培养基中的原料谷氨酸以几分钟的间隔加入培养皿中至培养皿中的浓度。对于所有位点观察到优异的线性，测定系数更大。每个通道的线性拟合。根据方程式，使用校准曲线的线性区域来确定谷氨酸浓度。还计算每个记录位点的灵敏度以研究所开发的谷氨酸微生物传感器的位点之间可能的灵敏度差异。校准试验的斜率跨天的平均值为整体灵敏度。正如所料，探针位点之间的灵敏度略有不同，这可能是由于手动施加到每个位点的酶数量的变化以及电沉积过程中膜厚度和性质的变化。电位差在表面的铂微电极也可能导致灵敏度的差异。
　　 较低的清除率通常表示较慢的间隙。预期正常功能的星形胶质细胞具有比肿瘤细胞更快的清除率。这种行为不是研究人员在实验中发现的;但是，这可以解释如下。正常的谷氨酸转运有的机会在星形胶质细胞上扩散兴奋性氨基酸转运蛋白，然后再运输到细胞中。因此，由于兴奋性氨基酸转运蛋白的潜在释放，探针可以在更长的时期内检测到一些最初添加的谷氨酸。这可能有助于探测器的电流并减慢返回基线的速率，产生较慢的清除率并延长峰值持续时间。两种细胞类型的残留值在某种程度上聚集成水平，表明清除率取决于添加的谷氨酸的浓度。已经显示一些神经胶质瘤细胞通过交换器释放谷氨酸，甚至达到神经毒性浓度。然而，研究人员没有想到从系观察到与交换器相关的谷氨酸释放。使用比色测定法对这些细胞中谷氨酸摄取的先前测试支持这种缺乏生产。在那些测试中，谷氨酸校准曲线相比，未检测到实质性的谷氨酸释放，类似于研究人员的探针校准范围。神经胶质瘤细胞上升时间周期内残留值水平缺乏也可明显减少摄取。
　　 还计算每组的上升时间，发现星形胶质细胞胶质瘤细胞。这些平均值之间的差异不显着。鉴于探针位点的电流上升可能主要是添加谷氨酸的扩散，这对于两种类型的细胞都是相同的条件，预期的相似性。但是，剩余价值对于增加浓度的谷氨酸的星形胶质细胞反应再次分组对应于浓度的水平，对于神经胶质瘤细胞没有明显的水平。该分组表明在这个相对短的时间窗内星形胶质细胞的谷氨酸摄取取决于浓度。研究人员没有模仿谷氨酸扩散在这项工作，但是这已经由他人完成。预计这种扩散会在生理温度下增加，如在这里进行的。因此，正如研究人员所测量的那样，可以预期数千平方微米/秒的扩散，并且它与秒范围内的上升时间一致。在这方面，上升时间也可以是最初在培养皿中达到浓度平衡的时间的指标。显示了三种情况下的实时数据采集。这些是在细胞培养基中增加的谷氨酸浓度，其中没有细胞，星形胶质细胞和相同类型培养基中的神经胶质瘤细胞。在校准期间，其中不存在细胞，因此不存在摄取的细胞机制，随着谷氨酸周期性地添加到培养基中，痕迹以逐步增加的方式出现。相反，如前所述，星形胶质细胞的动态摄取和来自转运蛋白的谷氨酸的扩散有助于更复杂的峰动态。然而，肿瘤细胞的电流痕迹更类似于没有细胞的培养基中的记录。因此，当前记录中的阶梯痕迹的出现可以用作神经胶质瘤细胞对谷氨酸摄取受损的生物标志物。
　　 如星形胶质细胞的实时测量所示，细胞以持续的方式继续从培养基中除去谷氨酸。这种去除在更长的峰值持续时间中是明显的，其中谷氨酸浓度逐渐降低，继续朝向基线，表明星形胶质细胞最终摄取全部或大部分添加的谷氨酸。另一方面，神经胶质瘤细胞的具有与没有细胞的测量相同的阶梯状响应，其具有较慢或没有返回基线，这对于谷氨酸摄取受损是预期的。的瞬态电流之后加入谷氨酸降低达到峰值浓度中没有细胞，星形胶质细胞和神经胶质瘤细胞是由于生物传感器消耗了谷氨酸。然而，没有细胞，随着谷氨酸浓度增加，信号随时间增加。对于受损的神经胶质瘤细胞，在低浓度谷氨酸时观察到适度的基线回归，但在较高浓度下，未观察到返回基线，表明它们不再能够摄取谷氨酸。研究人员开发了一种高灵敏度，基于酶的电化学探针，可以实时和多个位置测量谷氨酸浓度和摄取。探针可以测量氨酸与总灵敏度的基础培养基和磷酸盐缓冲盐水缓冲液，其是在其它的提高出版微电极阵列谷氨酸生物传感器。此外，研究人员已经开发出一种方法来分析微生物传感器的电流痕迹特征和残留值的分布，以区分胶质瘤细胞中谷氨酸转运受损和星形胶质细胞中正常的谷氨酸转运。先前已有人提出，谷氨酸摄取受损对癫痫发作的发展有贡献和神经胶质瘤患者的癫痫发作。因此，所开发的探针可以有益于监测从癌症到癫痫的疾病中谷氨酸转运的损害，并且用于评估潜在治疗剂治疗这些疾病的效果。