质子辐射比光子辐射诱导更强的细胞凋亡
　　 为了探索这种可能性，研究者随后确定了两种治疗方式在诱导细胞凋亡中的功效。细胞凋亡的核心是胱天蛋白酶-3和聚ADP-核糖聚合酶（PARP）切割，然后激活和DNA片段化。免疫印迹分析显示，在IN528和T4213GSC中，质子辐射在照射后引起的胱天蛋白酶-3裂解显着强于光子辐射。质子辐射还诱导比光子辐射更强和更持久的PARP裂解。此外，质子辐射不会在U251胶质瘤细胞中诱导更多的caspase-3和PARP裂解）。与这些发现一致，质子辐射在IN528和T4213GSC中诱导强烈的细胞凋亡，但在U251神经胶质瘤细胞中没有诱导，暗示质子治疗辐射诱导的对GSC的生物学效力的可能选择性。有趣的是，质子辐射诱导的细胞凋亡随着时间的推移（3-6天）不断增加，而光子辐射诱导的细胞凋亡在相同的时间段内减少。这些发现表明，与光子疗法相比，质子辐射诱导的DNA损伤和细胞毒性更不可修复，并导致GSC中进一步的细胞凋亡。

质子辐射诱导ROS的强烈产生以诱导细胞毒性
　　 辐射诱导通过直接DNA断裂和间接通过（ROS）的生成的活性氧物种的DNA损伤和细胞毒性。与光子相比，质子是具有更大质量的带电粒子，并且能够朝向SOBP的远端边缘产生更高的电离密度区域，这可能产生更多的ROS。研究者通过检查ROS的作用探索了质子辐射诱导的生物效应的可能机制。研究者的数据显示质子辐射比光子辐射诱导更多的ROS产生，在辐射后的前20个小时内水平不断增加并且在照射后3天观察到巨大水平的细胞内ROS，如7倍增加所示。这表明ROS可能在质子疗法的更大功效和相关细胞毒性中起关键作用。为了验证这一假设，研究者在治疗前一小时用ROS清除剂4-Hydroxy-Tempo（TEMPOL）（10mM）处理GSC。这一添加成功地消除了质子辐射诱导的ROS生成，研究者的结果表明用TEMPOL预处理GSCs显着防止了质子辐射诱导的细胞毒性，5Gy质子束辐照细胞几乎完全恢复了克隆形成能力。

ROS是质子辐射诱导的DNA损伤和修复所必需的
　　 然后研究者研究了ROS在质子辐射诱导的DNA损伤和修复中的作用。研究者的数据显示用TEMPOL预处理细胞显着降低了单链和双链DNA断裂的程度，表明质子辐射通过ROS产生诱导更大量的DNA损伤。此外，与单独的质子疗法相比，与TEMPOL一起温育更迅速地促进H2AX磷酸化，如通过增加和延长的磷酸化所示。这表明ROS在改变辐射后GSC的修复能力中起关键作用，并暗示质子治疗产生的大量ROS在其细胞毒性中起主要作用。

　　研究者的研究表明质子辐射比光子辐射诱导更强大的DNA损伤，细胞毒性和细胞凋亡，这是第一次使用特征性癌症干细胞。研究者发现，这种增强的功效与增加的DNA损伤，减少的DNA修复，改变的细胞周期分布和增加的胱天蛋白酶-3活性有关。此外，ROS清除剂TEMPOL的引入减少了质子治疗的效果，这表明ROS依赖性机制。
　　 癌症干细胞已被很好地表征在GBM。以前的研究已经证明了GSC在GBM的放射抗性中的关键作用。因此，靶向并消除的GSC是克服在GBM的治疗性临界。虽然被科技部确定的GSC是抗辐射，一些GSC中展示了一系列放射敏感性的，可能是由于不同的分离和培养方法，种群异质性和不同的遗传状态（前列腺，神经，经典或间充质）。大多数癌症干细胞具有很强的顽固传统的放疗和化疗，主要是由于其固有的能力来修复DNA和清除自由基，例如，乳腺癌干细胞具有增加的ROS介导和增强的DNA修复。然而，这些特征尚未在GSC中得到很好的证实。在这里，研究者的数据表明ROS的产生对DNA损伤和GSC的修复减少至关重要。研究者的研究一致表明，X射线光子辐射诱导最小量的DNA损伤并在GSC中产生较少量的ROS，从而为其治疗无效性提供解释。更重要的是，研究者的数据表明，质子辐射会引起明显的ROS生成，这可能超过容许的ROS阈值和GSC的清除能力，并最终导致细胞凋亡。同样，最近的研究表明质子辐射诱导多种类型癌细胞中的ROS产生。此外，GSC中质子辐射诱导的延迟H2AX磷酸化表明质子辐射也抑制DNA修复，可能是因为产生的高水平ROS可能改变关键DNA修复激酶的活性水平，包括ATM，ATR和DNA-PK。
　　 作为带正电荷的粒子，质子通过与DNA分子的直接碰撞和通过产生ROS的间接DNA损伤引起DNA损伤和细胞毒性，并且由于它们用于放射疗法的相对高的束能量（通常为70至250MeV，因此比光子更有效）。与X射线辐射4至20MeV相比）。然而，在这里研究者表明，质子辐射对GSC的主要细胞毒作用是通过产生大量的细胞内ROS及其间接作用，这可以通过引入ROS清除剂TEMPOL之前减少的DNA损伤和细胞凋亡来证明。与质子辐射相关的强大ROS产生可能是由于其直接作用和/或随后的辐射诱导的线粒体功能障碍。与此观点一致，用自由基清除剂预处理可以增加辐射后的细胞存活率。
　　 鉴于质子辐射在大多数类型的细胞和组织相比，常规光子治疗时仅诱导更高的10％的相对生物学有效性（RBE），它已被普遍接受的是质子治疗是不可能的，以提高整体的患者存活。然而，最近的研究结果表明，质子治疗提供了在非小细胞肺癌和脑膜瘤局部控制。事实上，RBE的估计取决于细胞类型和选择的检测方法，因为已经证明，DNA损伤和凋亡反应在γ辐射和质子治疗之间以组织和剂量依赖的方式变化很大。有趣的是，以前的数据表明质子辐射比各种癌细胞类型中的光子辐射诱导更多的细胞凋亡。此外，最近的一项研究表明，质子辐射对肺癌干细胞样细胞具有选择性细胞毒作用。研究者假设这是由于内在的ROS耐受性和ROS的产生在不同的细胞类型和治疗方式中有所不同。此外，与传统的X射线光子辐射相比，质子束治疗具有更高的线性能量转移（LET）速率，特别是朝向SOBP的远端边缘。较高的LET可以增强RBE，其由具有质子处理深度11的增加的RBE支持。然而，LET在辐射效应中的具体作用仍然很大程度上未知。
　　 总之，研究者表明质子辐射通过ROS的产生比光子辐射更有效地消除GSC。这些发现表明质子辐射是治疗GBM的首选疗法，特别是其消除GSC的能力。在GSC后处理中观察到的动态生物效应包括细胞周期再分布，DNA损伤和修复以及ROS产生，提供了对GSC对质子辐射的细胞反应的一些了解。更重要的是，该研究表明，通过优化的剂量分级，质子治疗最终可以改善GBM患者的临床结果。